基因治療的基本策略模板(10篇)
時間：2023-07-14 16:25:05
導言：作為寫作愛好者，不可錯過為您精心挑選的10篇基因治療的基本策略，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內容能為您提供靈感和參考。
篇1
目前我國基本醫療保險已經覆蓋12.95億人，覆蓋95%以上人口。隨著我國醫療衛生體制的改革，覆蓋面已經基本涵蓋了城鎮居民、農民及外出打工人群。人們在享受醫療保險帶給我們醫療保障的同時，醫療費用的快速上漲，也給醫保基金帶來了沉重的負擔。因此，若何有效控制醫療保險費用的過快增長，是醫療保險制度健康、有序、穩步發展的前提，是保障人民群眾健康的物質基礎，同時，也是醫療保險事業平穩運行的基石。本文結合醫療保險管理的實際，對我國醫療保險運行機構如何控制醫療保險費用的過快增長進行分析和探討。
一、醫療費用過快增長的原因分析
引起次均醫療費用和就醫頻率增加的因素很多，從對部分省份醫療基金運行的實際情況分析，主要影響因素包括以下方面：
（一）正常醫療需求的增加。
一方面，基本醫療保險制度從無到有，居民生活水平不斷提高，使人們的醫療需求得以正常釋放，直接影響到了就醫頻率的增加。同時，2009年開始，各統籌地區為了合理控制醫療保險統籌基金的結余規模，分階段、不同程度地對本統籌地區醫療保險待遇政策進行了調整。例如：提高醫療保險統籌基金年度最高支付限額和共付段醫保基金支付比例、增設門診大病病種等。在降低參保人員個人負擔的同時，提升了參保人員的就醫意愿，從而影響到了就醫頻率的增加。
另一方面，我國城鎮職工參保人群年齡結構處于一個逐漸老化的趨勢中，各種慢性疾病、危重病發生概率增加，直接導致就醫頻率和次均費用的增加。統計數據顯示，退休人員的次均門診費用與在職人員差別不大，次均住院費用、門診就診率和住院率卻差別明顯。
（二）以量補價的過度醫療現象普遍存在，推動醫療費用大幅增加。
受國家價格政策因素的影響，醫療機構通過提高醫療收費項目價格的創收途徑受到制約，同時又由于我國絕大部分統籌地區均采用項目付費的結算方式，刺激了各醫療機構通過增加醫療服務提供量和種類來創收。以量補價的過度醫療情況已成為我國醫療費用不合理支出快速增加的重要原因。
（三）先進醫療技術在臨床推廣，對高級別醫院的次均費用影響較大。
隨著科學技術的迅速發展，新的醫療儀器設備、藥品和診療技術層出不窮，極大地提高了診療水平，在解決疑難雜癥方面起到了重要作用。與此同時，醫療技術的進步，其本身的高科技價值也帶來了醫療費用的攀升。
二、控制醫療費用上漲的應對措施
醫療衛生資源的有限性與醫療服務需求的不斷膨脹之間的矛盾，醫療保險籌資與支出之間的矛盾，醫療保險支出與積累之間的矛盾，是關系到社會保險事業持續發展的關鍵。根據醫療費用上漲的特點，在保障醫療需求合理增加的前提下，結合電力行業實際，應從以下幾方面采取措施，控制醫療費用的快速上漲。
（一）加大醫保政策宣傳力度。
我國現行的是“低水平、廣覆蓋、保基本”的醫療保障制度和“以收定支、收支平衡、略有結余”的基金管理原則。醫保部門應加強醫保政策的宣傳，使參保人員明白基本醫療保險保的是基本醫療，而不是特需醫療。基本醫療就是因病施治，進行合理的檢查、用藥及治療。不根據病情需要，盲目要求醫生多開藥、開貴藥，不僅不能對癥治療，還會給自己和醫保基金造成浪費。
（二）加強政策引導，合理分流病人。
建立雙向轉診制度，合理分流參保人員到適合自身疾病治療的相應級別醫院就醫。為促使雙向就診制度的有效實施，醫療保險經辦機構應積極主動延伸服務，一方面將各定點醫療機構收治的各類常見病的治愈率、次均醫療費用、平均住院天數、個人負擔、病人滿意度等多種信息定期對外公布；另一方面，對我國醫技高超、醫德高尚的醫務工作者，醫療保險經辦機構可以主動進行宣傳，盡量減少病人和醫院之間的信息不對稱程度。
（三）實施醫療保險定點醫生管理制度，強化醫務人員的自律性。
隨著我國五險合一的金保工程二期信息系統在部分地區范圍內逐步推廣使用，對醫療保險定點醫療機構精確化管理程度提高，管理落實到醫生的條件已基本成熟。可以建立部分地區醫療保險定點醫生庫，制定定點醫生誠信評判標準和激勵機制，建議全國各省份人力資源和社會保障管理部門將醫保定點醫生的誠信狀況作為醫生職稱評定的標準之一，提升醫生提供醫療服務的自律性。
（四）加強醫保稽核管理，確保基金安全。
加強醫保稽核管理，加大對違規行為的查處力度，對參保人員將醫療卡、證轉借他人使用，惡意騙取醫保基金等各種違規行為，要加大查處打擊力度，以此強化就醫管理，促使參保人員規范就醫行為。如：把醫保稽核作為醫保工作重心之一，通過加強對監管，有效遏制分解住院、降低入院標準、掛床、冒名住院、虛擬住院、過度治療等不規范醫療服務行為，促進醫療服務質量的提高，維護參保人的權益。
（五）完善醫療保險定點醫療機構管理質量評價機制，實施定點醫療機構分級管理。
篇2
【中圖分類號】R341 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）13-0013-02
目前，基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是一種頗具臨床應用潛力的治療策略， 但是由于治療的靶向性成為關系到治療安全性的瓶頸問題。近年來研究表明[1-5]，超聲微泡造影劑有望成為一種新型的體內靶向給藥的載體系統。本研究旨在構建超聲微泡包裹的特異性雙自殺基因慢病毒載體，為臨床實時可視狀態進行超聲定位控釋和載質粒微泡基因治療奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的構建與包裝
1.1.1目的基因的擴增與TA克隆
提取正常人外周血gDNA，并通過PCR方法擴增出KDRP、CD、TK基因；回收
PCR產物并分別將其鏈接到pMD18-T載體上，構成重組T質粒；抽提質粒，并對各重組T質粒的酶切鑒定及測序；
1.1.2 慢病毒載體構建與包裝鑒定
將經測序證實的T-KDRP、T-CD、T-TK三種質粒上的KDRP、CD、TK元件通過特定的限制性內切酶酶切后，依次連接到經相應酶酶切的pLenti6-EGFP載體上，經脂質體法轉染至293T細胞，24h后通過熒光顯微鏡即可見GFP熒光表達，72h后收集上清，0.45um濾器過濾，25000rpm離心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃貯存備用。將梯度稀釋的病毒液，加入293T細胞中，72h后置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，計數發熒光細胞數目，根據病毒用量和稀釋度計算滴度。按公式計算病毒滴度：
病毒滴度=GFP細胞陽性數×病毒上清稀釋倍數/0. 4m1（pfu/ml）。
1.2 載藥粒微泡的制備于鑒定
1.2.1載藥粒微泡的制備
聲諾維sonovue為磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用說明注入生理鹽水5 ml震蕩形成微泡混懸液。取50ul微泡懸液于1.5mlEP管內，再滴加入100MOI病毒載量的病毒上清液，輕輕混勻后室溫孵育20 min。
1.2.2載藥粒微泡的鑒定方法。
采用Malvern激光測量儀檢測載藥微泡的粒徑大小，光學顯微鏡觀察其外觀，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定載藥微泡的包封率和載藥量。
（1）粒徑大小比較
載質粒微泡為白色混懸液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸鹽緩沖生理鹽水）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。去除上層及下層液，取中層液，測定其粒徑大小，鏡下比較觀察載藥微泡與空白微泡外觀。
（2）包封率的測定
將制備好的含有慢病毒載體的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混勻，6℃，16000 rpm高速離心20min，去上層微泡，取下層液體，加5%乙醇0.5 mL稀釋沖洗，再加入適量乙醚，漩渦振搖，6000 rpm離心15 min，取乙醚層，50℃水浴揮干后，加0.5 mL甲醇溶解作為樣液，進樣量10μL。采用RP-HPLC測定雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式計算包封率：
包封率（%）=[（投入藥量―游離藥量）/投入藥量]×100%
（3）載藥量的測定
以下式計算載藥量：
載藥量%=（Wt～Wi）/Wc×100%
其中Wt為脂質微泡溶液中藥物總含量，Wi為游離藥物量，Wc為磷脂用量。
（4）穩定性測定
4℃冰箱貯存，對短期內的載藥微泡溶液的質量進行監測。
取少量載藥微泡混懸液分別于1d、2d、5d、8d、10 d經光學顯微鏡（×400）進行觀察其形態變化。第10 d的取該樣品由Malvern粒徑測量儀檢測粒徑。4℃冰箱貯存10 d后，RP-HPLC測定載藥微泡溶液的包封率。
2 結果
2.1 病毒滴度檢測結果：
經熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，計數發熒光細胞數目，根據病毒用量和稀釋度，獲得病毒滴度為（3.5×1012pfu/L）的雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 載藥微泡質量鑒定：
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的聲諾維微泡與空白聲諾維微泡粒徑的對比觀察：
載質粒微泡呈乳白色混懸液，用磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate buffered saline PBS）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。
鏡下比較觀察載質粒微泡（圖A）與空白微泡（圖B）的形態，其形態相近，為近似的圓形微泡。其粒徑范圍92%在2～5μm之間，平均粒徑約2.90μm（圖A），粒徑大小均相似。
2.2.2 包封率和載藥量測定結果
采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定載藥微泡的包封率和載藥量，
得到結果：
包封率為90.6±3.1%。載藥量為29.2±0.9%。
2.2.3 穩定性測定：
4℃冰箱貯存10 d后，可見仍為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡粒徑大小未見明顯變化，微泡形態好，大小均勻，相互之間無明顯聚集現象，分層情況基本同前，樣品經光鏡下觀察及Malvern測量儀檢測發現，與制備初始相比，平均粒徑大小約3.08μm），未見明顯變化；RP-HPLC測得包封率：86.1±2.8%，沒有出現明顯藥物滲漏。
3 討論
基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是近年來新興的腫瘤基因治療的研究熱點。自殺基因療法是利用基因工程技術將自殺基因轉入腫瘤細胞進行表達，注入體內的無毒或低毒的前藥在表達的特異性酶作用下轉化成毒性產物，該產物可作為DNA合成的核苷替代物摻入到DNA中，干擾細胞DNA的合成，從而引起腫瘤細胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是將PCR產物直接與表達載體相連接，而是先將PCR產物TA克隆，構建成重組T質粒后再將目的基因與表達載體酶切連接，主要是考慮到：PCR產物直接進表達載體成功率不高；而先進T載體，再酶切連接表達載體，可減少堿基錯配，提高成功率。目前己發現的自殺基因體系已有十多種，本實驗選擇胞嚓陡脫氨基酶基因（CD）和單純疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK簡稱TK）來構建雙自殺基因質粒，是因為研究表明[7]，二者作用機制具有很強的互補性，將其連接在一起，構成融合基因，使兩個自殺基因體系協同作用，能顯著增強對腫瘤細胞的殺傷作用。同時選用腫瘤特異性啟動子KDRP，突破對腫瘤細胞類型的依賴性，擴大腫瘤基因治療譜。運用增強型GFP綠色熒光蛋白作為報告基因，可直觀的檢測目的基因的檢測和計算病毒滴度。而慢病毒載體最大的特點是可以感染分裂期及非分裂期細胞，容納外源性目的基因的片段大，可以在體內長期地表達，不易誘發宿主免疫反應，安全性較好，可在更多范圍的宿主細胞內生成高滴度的病毒，己成為當前基因治療中載體研究的熱點。
超聲微泡造影劑聲諾維可作為一種新型基因載體。在一定劑量超聲波的輻照下，利用微泡在超聲介導下的空化效應介導目的基因的靶向釋放和導入。國內外許多學者通過體內外實驗證實空化效應是超聲介導基因轉染的主要機制，微泡造影劑作為外源性空化核被引入體內后大大增加了單位體積內空化核的數量，降低超聲波的空化閉值，增強空化效應，從而提高基因轉染效率[3-4]，尤其在抗腫瘤治療、溶栓治療等方面具有潛在的重要應用價值。經靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波作用下會不斷地產生非對稱性收縮和膨脹，當聲能達到一定強度時，微泡破裂藥物被釋放到超聲所輻照的局部組織中。在這一過程中，微泡作為空化核增強空化效應，依靠能量輻射作用，使微泡破壞后釋放的藥物能夠進入血管壁甚至組織間隙，從而發揮定位靶向治療作用[2]。
而載藥微泡的外觀、粒徑大小、包封率、載藥量等是衡量載藥脂質微泡質量的最重要指標。我們制作的載雙自殺基因慢病毒載體微泡乳化良好，大小均勻，粒徑范圍92%在2-5μm，與空白微泡相似。微泡內藥物的包封率為90.6±3.1%，載藥量為29.2±0.9%，均達到較理想的水平。此外穩定性也是衡量載藥脂質微泡特性的主要指標之一，它能反映脂質微泡溶液包封率隨時間變化的情況。脂質微泡作為藥物載體穩定性是指被包裹藥物在脂質微泡中的滯留性。經由本實驗證實，我們制作的載藥微泡同時也具有較高的穩定性。
本研究聯合了雙自殺基因的殺傷效應、KDR啟動子的腫瘤特異性、慢病毒載體的高載性和超聲微泡靶向的可控釋性等多種技術優點，制備出了較為理想的載有靶向基因藥物的微泡，期望為進一步臨床實施可視狀態下的腫瘤的基因治療提供一種更加安全、高效的策略。
參考文獻
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作者簡介：
郝軼，碩士，主治醫師，新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，830011。
基金項目：
篇3
對于顱內膠質瘤的研究已經有一個多世紀的歷史，以前的治療方式都是對患者大腦半球切開，即使這樣，患者仍然會受到腫瘤復發的困擾。現如今，醫學研究人員會將手術切除、手術之后的化療和放療進行綜合使用。近年來，一些新的觀念和研究方式層出不窮，醫學研究人員在不斷進行臨床研究，效果明顯。
1膠質瘤的手術前評估和手術切除
一般來說，手術切除是治療膠質瘤的一種具體的途徑[1]。在進行手術之前，工作人員應該對腫瘤的生長速度，具體的部位以及血供情況進行全面地探討和分析，做到全方面地了解。不僅如此，醫學研究人員還需要對患者的年齡，遺傳信息等進行調查，將其寫到治療方案當中，做好預測工作。
正常來說，手術應該以全切形式為主，現如今，醫生所應用的手術形式就是以熒光引導。由于人體內部所含有的氨基乙酰丙酸是血紅素合成的主要產物，這種物質可以被腫瘤轉化為卟啉，能夠用以輔助殘留腫瘤，其本身的實用價值比較高。在實際的研究中證明，全切的手術方式不僅效果比較明顯，而且還會減少復發率。
功能磁共振也是一種比較典型的治療方法，這種治療方式往往應用到無創性手術。研究人員可以在不造成任何損壞的情況下進行明確地定位，對于成像效果來說，采用彌散張量成像的形式是比較常見的。可以通過對白質纖維受壓位移情況進行了解之后，才能夠提供更為合理的建議。對術前的信息進行全面地了解，可以推動腫瘤切除手術的敏感程度，這樣可以有效的減少腦功能，同時還有助于腫瘤切除組織的高效發展。
現如今的安全手術方式有很多，其中比較典型的就是神經影像學。但是這種治療方式也具有一定的局限性，主要是通過對局部的血流量進行判定。皮層功能存在著嚴重的誤差，嚴重地影響到影像判定的精準度。另外，手術過程中的電生理監測也是一種標準的檢測方式，對語言區腫瘤的切除手術的正常進行會起到一定的促進作用[2]。
為了對手術切除程度和患者預后之間的關系進行全面地了解，研究人員做出了不同的實驗，結果發現，腫瘤全切之后患者的預后效果，以及生活質量等要明顯高于腫瘤半切的患者。因此，在實際的治療工作中，最好采用全切腫瘤的形式。
2術后的治療與放射治療
在高級別的膠質瘤進行切除手術后，很容易出現復發的現象。因此，做好放療和化療工作是治療腫瘤的重要途徑。但是現如今的放療和化療的效果度不是非常理想，主要的原因就是血腦屏障會對化療藥物的吸收產生一定的阻礙作用，耐藥性也比較強。傳統的輔助化療方式對膠質瘤不會產生任何的改善作用。從相關的臨床試驗中可以看出，很多藥物可以被應用到膠質瘤患者的放化療中，其中替莫唑胺就是典型的代表，不良反應也比較小。但是，膠質母細胞瘤等惡性的腫瘤對于替莫唑胺這種藥物也具有一定耐藥性，在手術的早期就應用相應的化療藥物可以藥物的藥效。因此，在手術之后采用替莫唑胺藥物進行化放療可以達到預期的效果。
在對顱內膠質瘤進行治療的過程中，甲基轉移酶也是研究人員研究的重點。如果膠質瘤呈現出陽性則耐藥性就比較強。因此，同樣可以也可以采用替莫唑胺來進行治療。
另外，放射治療也是比較重要的治療方式。在實際的診療工作中主要是通過高能射線引入到腫瘤組織當中，形成大分子的物質結構，其中比較典型的就是DNA物質。在這些大分子物質遭到損壞之后，就可以直接殺死腫瘤細胞。根據研究人員的實際研究，對于三級以上的惡性顱內膠質瘤而言，手術后放療的方式幾乎是一種普遍的治療方式。但是，不排除有腫瘤復發的可能性。防滲治療方式存在著一定的局限性，一些放射線可以對活躍期的細胞造成嚴重地破壞，而且腫瘤組織也會對放射線非常敏感。
TMZ無論是在體外膠質瘤，還是膠質瘤異體種植模型中均被作為放射增敏劑使用，其作用是導致有絲分裂死亡的增加而不是促進細胞凋亡或細胞周期轉折點的激活。這進一步鞏固了TMZ作為聯合放化療藥物的地位。
3膠質瘤的基因治療及其他新思路
基因治療是指使用病毒等載體將外源性基因轉染至患者腫瘤細胞，以對其進行殺滅或抑制其生長，主要的治療方案有：反義癌基因治療，自殺基因治療，抗血管基因治療，抑癌基因治療以及反義癌基因治療等。在體外實驗中，這些治療方案均在不同水平上被證明有效，然而，以病毒為載體的基因治療的臨床試驗顯示其對于延長患者生存期及限制腫瘤生長的效果并不顯著[3]，主要問題在于載體無法完整地分布于腫瘤組織，另外，載體DNA轉染的效率也偏低，如何在安全的基礎上提升基因轉運效率成為迫切需要解決的問題，在這樣的背景下，以神經干細胞為基礎的基因治療得到人們的重視。
4結論
總而言之，現階段顱內高級別膠質瘤的基本治療策略是在完善的術前評估下，進行以手術治療為基礎的綜合治療。憑借術中導航及神經電生理監測技術可以在保護腦重要功能結構的前提下盡量全切腫瘤，這為隨之而來的術后放、化療奠定了重要的基礎。以TMZ為基礎的輔助化療和聯合放化療已經成為新的治療標桿，對MGMT的測定為化療藥物的選擇提供了重要依據。
參考文獻：
篇4
肝臟血供豐富，是惡性腫瘤轉移的最常見的靶器官之一，在惡性腫瘤的發展過程中約25%-50%的原發腫瘤轉移至肝[1]。如何提高轉移性肝癌的治療有效率一直是腫瘤臨床工作的重點之一，正確認識肝轉移癌的一般規律和特點，對進一步提高該病的診治水平具有十分重要的意義。
1 肝轉移癌主要來源分析 常見肝轉移癌以消化道惡性腫瘤來源為主，所有的消化系統惡性腫瘤均可經肝動脈、門靜脈及淋巴途徑轉移到肝臟，其中以消化道腺癌經血行肝轉移最多見。
由于消化道原發灶全部由門靜脈回流至肝臟，且手術操作過程中牽拉、擠捏等常使脫落進入血管的腫瘤細胞首先進入肝臟，因而消化道癌易發生肝轉移。從分子生物學的角度考慮，消化道癌細胞表面的糖蛋白CEA具有類似免疫球蛋白類細胞粘附分子功能，它由肝臟清除，在肝內與肝細胞結合后，可作為粘附循環中腫瘤細胞的受體，而致腫瘤易在肝臟中滯留，進一步激活新生血管而形成轉移灶[2]。從環境土壤學說來看，肝臟血供豐富，能夠為腫瘤的高代謝特點提供營養保障。
2 肝臟病理損傷與肝轉移癌關系
2.1 肝纖維化/肝硬化與肝轉移癌關系 眾多的實驗及臨床研究表明肝纖維化/肝硬化患者很少發生肝轉移癌。大多學者認為肝硬化時形成諸多假小葉，由于再生的肝細胞結節的壓迫和結締組織的收縮，使肝內血管、膽管均發生扭曲和閉塞，酶學系也發生相應的變化，以及肝硬化時門靜脈壓力升高，肝臟收納胃腸系統的血流量減少。這些變化使已到達肝內的癌細胞不適宜“著床”及生長。
2.2 肝炎病毒感染與肝轉移癌關系 UtsunormiyaT[3]報告感染乙肝或丙肝病毒的結直腸癌肝轉移率(3/37,8.1%)較非感染者的肝轉移率(85/401,21.1%)明顯降低。HBsAg感染后出現肝功能損害、肝硬化可能是結直腸癌肝轉移的不利因素。病毒感染本身和其引起的局部免疫變化可能起著重要作用。肝炎病毒能夠引起特異性免疫反應，有效地抑制和殺滅循環中的腫瘤細胞；同時微環境中NK細胞和吞噬細胞的增加，大大增強了局部組織的免疫功能。
2.3 脂肪肝與肝轉移癌關系 Karube等[4]通過向患有脂肪肝的大鼠體內注入鼠結腸直腸癌細胞(RCN-9)，觀察到出現轉移性肝臟病變的大鼠數量明顯少于無脂肪肝的對照組，同時檢測到脂肪肝大鼠轉移病灶中的微血管密度(microvesseldensity,MVD)低于對照組大鼠，提示脂肪肝的環境不利于癌細胞的生長，轉移灶不易形成。
3 肝轉移癌的治療現狀分析
3.1 外科手術治療 結腸癌等原發病灶切除術后，盡可能行肝轉移灶切除術，外科手術依然是可切除病灶的標準治療，一旦有切除可能時，即應進行手術，從而最大程度減輕患者負擔，延長生存期。
3.2 局部治療方法 主要有射頻消融(RFA)、無水酒精注射、激光導熱治療(LITT)、微波凝固治療(MCT)、高功率聚焦超聲療法(HIFU)、冷凍治療、電化學治療等方法，其原理主要是采用物理或化學的方法導致癌細胞死亡。
3.3 化療 肝臟出現轉移灶是原發腫瘤發生遠處轉移的晚期癥狀表現，已處DukesD期，不管能否切除轉移灶，原則上均需根據轉移癌的病理類型選擇敏感藥物化療。給藥途徑有全身和區域性。
3.4 放療 肝轉移癌的癌細胞大多數是消化道來源的腺癌，對放療低度敏感，肝臟組織對放射線的耐受性差，全肝區放療已基本放棄不用，病灶聚焦放療有時仍在應用，如γ刀、光子刀等的治療。
3.5 生物治療 生物治療包括免疫治療和基因治療兩大類，免疫治療是調動機體各種積極防御因素，提高機體免疫力，能過免疫機制達到治療腫瘤的目的。基因治療是應用基因工程技術，干預存在于靶細胞的相關基因表達水平以達到治療目的，包括直接或間接抑制或殺傷腫瘤細胞，歸納為細胞因子、腫瘤疫苗、腫瘤藥物基因治療及調整細胞遺傳系統的基因療法，目前研究較多的是殺傷或抑制腫瘤細胞生長的基因、增強腫瘤細胞免疫原性的基因、耐藥基因等。
3.6 中醫藥治療 中醫藥治療惡性腫瘤病人,應用祛邪、扶正、化淤、軟堅、散結、清熱解毒、化痰、祛濕及通經活絡、以毒攻毒等原理，以中藥補益氣血、調理臟腑，配合手術后、放療和化療的治療、還可減輕毒副作用。
4 肝轉移癌的現代治療策略 近年來，圍繞提高肝轉移癌手術切除率和延長生存期，提出多學科專家組(multidisciplinaryteam，MDT)治療模式[5]。在病人治療前、治療中和治療后，由多個學科專家組成診療小組，定期進行會議，以病人為中心，討論決定適合每個病人不同病期的診斷治療方案，以使病人獲得最佳的預后。
5 展望 各種治療方法均有不同程度的缺陷，比如手術及各種局部治療方法包括動脈栓塞化療在內，對于潛藏在門脈系統內的微小病變不能處理，從而導致復發；全身靜脈化療往往因藥物副作用不能使病灶內藥物濃度達到最佳水平，致使腫瘤細胞出現耐藥性等。相對而言，利用氣囊導管實施的經皮肝隔離灌注術值得研究[6]。
參考文獻
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篇5
2．心力衰竭的基因治療
心臟收縮-舒張過程中任何一個環節的功能障礙都可能導致心肌的收縮和/或舒張功能降低，從而誘發心力衰竭的產生。心力衰竭的基因治療靶點即針對此過程中的鈣循環相關蛋白和調控因子。基因治療包括三個基本要素:基因載體、轉移方式和靶基因。
(1)基因載體靶基因需要通過特定的載體轉移到靶細胞中去，目前常用的基因載體主要分為非病毒載體和病毒載體兩大類。非病毒載體可大致分為質粒DNA、脂質體DNA復合物和高分子DNA復合物。寡核苷酸類及其類似物，亦可單獨或以復合物的形式作為一種非病毒載體用于基因轉移。一種可降解的高分子聚合納米粒子，具有強大的核酸容量，避免了腺病毒轉染有關的安全問題，適合作為基因載體，已得到了美國FDA的批準［3］。病毒載體在臨床前研究中應用更為廣泛，主要包括腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、反轉錄病毒和慢病毒載體，病毒載體的應用大大提高了基因轉移的效率。重組人類腺病毒載體是轉基因治療模型中最常用的載體，它的優勢在于:擴增相對容易，可以達到較高的病毒滴度發揮功能，對靶細胞存在尤其是對心血管系統廣泛親嗜性。無論在體內還是體外環境下，絕大部分心肌細胞都可以被腺病毒有效轉染。然而，將腺病毒應用于臨床仍面臨許多挑戰。腺病毒進入機體后，可能會引起強烈的免疫和炎癥反應，這將限制其后續的表達。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝臟)，不能呈現理想的組織選擇性。相對于腺病毒，雖然AAV、反轉錄病毒和慢病毒載體有著較低的免疫原性，但是AAV難以達到高效價的病毒滴度，對靶基因的裝載能力有限以及人體本身存在中和抗體等。反轉錄病毒載體不能轉染類似心肌細胞的不分裂細胞，慢病毒的生物安全性尚待評價。
(2)載體轉移途徑目的基因轉移到靶細胞，除了需要適宜的載體，還要有適合的轉移途徑。一些可增加血管通透性的化學物質曾被用于促進載體從血管腔轉移至心肌，如硝酸甘油、硝普鈉、5-羥色胺、緩激肽、組胺及血管內皮生長因子等，但是對于臨床心力衰竭患者，考慮到以上物質有降低血壓的作用，需謹慎應用。常用的轉移途徑包括:①順向注射法:一種為阻塞冠狀動脈的順向注射法，即用球囊阻塞冠狀動脈近端，使病毒載體不會逆流或被稀釋，但此法存在安全隱患，因為即使短時間的冠狀動脈阻塞也可能不能耐受;另一種為非阻塞冠狀動脈的延長順向注射法，此法用于AAV的轉移最為有效，而且可作為心力衰竭患者不能耐受冠狀動脈阻塞法的最佳選擇。盡管這種方法并不能感染所有心肌(約60%)，但它更符合冠狀動脈的正常生理血流特點。重度心力衰竭患者接受攜帶SERCA2a的AAV1轉染的臨床研究，即采用了延長順向注射法。另一種為循環灌注技術，通過經皮的最小微創手術建立心肌的獨立灌注區域，使冠狀動脈和冠狀竇之間形成一個閉合回路，此法在攜帶SERCA2a的腺病毒載體和AAV轉染綿羊心力衰竭模型中應用，證實可顯著改善心肌收縮力［4］。②逆向注射法:經冠狀靜脈逆向注射對于有冠狀動脈疾病的患者來說是一個非常好的選擇。然而，逆向注射法對不能耐受冠狀動脈阻塞的患者也存在操作困難。③直接注射法:經過外科手術或經皮介入將載體直接注入到心肌組織，此法可避免許多血管內途徑帶來的潛在弊端:肝臟和脾臟的首過消除作用、中和抗體的效應、T細胞應答以及血管內皮屏障的不滲透性。直接注射法僅將病毒載體轉移至注射部位心肌。④心包腔途徑:經由心包將載體轉移，載體會優先在心包鄰近的心肌細胞中表達。如何最優化心包轉移法的治療效應主要取決于多少比例的靶組織需要被糾正。局灶性的基因轉移適于局部缺血的心肌組織，彌散性的基因轉移更適于糾正整體的心功能不全。⑤手術轉移:通常需對實驗動物進行開胸手術，繼而采用直接、順向或逆向注射。然而，臨床心力衰竭患者能否耐受此法尚待進一步研究證實。
(3)靶基因理想的靶基因應具備以下特性:在心力衰竭動物模型證實能改善心功能，無致心律失常性，量效關系明確，即靶基因表達越多，心臟功能的改善越明顯［5］。如表1所示，迄今用于心力衰竭轉基因治療的靶基因包括［6-18］:鈣循環相關蛋白:①過表達SERCA2a:早在20余年前，Gwathmey等即發現，無論心力衰竭病因如何均存在明顯的鈣循環異常，且部分歸因于SERCA2a的活性下降。大量的心力衰竭動物模型結果顯示，過表達SERCA2a基因可顯著增加心肌收縮功能，在容量負荷過重所致的心力衰竭豬模型，甚至可改善心室重構［6-7］。另外，過表達SERCA2a可修復心肌能量供應和利用的失衡，降低室性心律失常發生，增加冠狀動脈血流［8，19］。②抑制PLN:抑制PLN的表達，可起到與過表達SERCA2a相似的效應，進一步改善心肌的收縮和舒張功能。在起搏誘導的羊心力衰竭模型，通過基因沉默抑制PLN的表達，2周后，即顯示PLN抑制組左心室舒張末徑顯著減小，射血分數顯著增加［9］。利用RNA干擾技術，將攜帶抑制PLN表達的基因序列的AAV9，通過靜脈注射轉染心臟結果顯示:PLN蛋白表達下降了75%，SERCA2a的活性部分恢復，心力衰竭大鼠的血流動力學特性顯著改善，收縮功能、舒張功能各項指標均恢復正常，心室肥厚、心肌纖維化程度均明顯下降［10］。③S100A1:S100是一類鈣結合蛋白，其中S100A1主要在心臟表達。S100A1參與了對細胞內外Ca2+調控的多個環節，可增加肌漿網SERCA2a和RyR2的活性促進心肌的收縮和舒張，調節細胞膜的順應性和對Ca2+的反應性，調控Ca2+介導的線粒體的能量代謝［20-21］。在心肌梗死后心力衰竭豬模型，通過冠狀靜脈逆向轉移法，將AAV-S100A1注射至左心室非梗死區結果顯示:注射14周后，S100A1治療組修復了肌漿網的鈣循環障礙，抑制了進行性的心功能下降，逆轉了左心室重構，且不增加室性心律失常的誘發率，證實了S100A1轉基因治療的長期有效性和安全性［11-12］。β腎上腺素受體(β-AR)系統:心力衰竭患者的β-AR往往呈現為表達下調。將攜帶β2-AR的腺病毒經冠狀動脈轉染兔心肌細胞，發現在轉染后第1周、3周時，反映心肌收縮力的指標dP/dtmax明顯增加，且心肌細胞對β-AR激動劑異丙腎上腺素的反應性顯著增強［22］。過表達β2-AR的小鼠亦顯示心臟功能得到明顯改善。G蛋白偶聯受體激酶(GRK):β-ARs與G蛋白之間的相互作用是通過激酶對偶聯受體的磷酸化調節作用來實現的。GRK2是心臟中表達最多的GRK，它在心力衰竭時表達增加，導致β-AR信號通路敏感性下降，功能障礙。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，選擇性的抑制GRK2表達，結果發現10天后，GRK2抑制組小鼠生存率增高，心室重構延緩，心肌的收縮力增強［23］。β-ARKct多肽是GRK2介導的β-AR失敏的抑制劑。將攜帶β-ARKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔，發現轉染后3周，心室功能明顯改善［16］。β-ARKct過表達的陽性結果在豬的心力衰竭模型上亦得到驗證［17］。腺苷酸環化酶(AC):心肌細胞接受兒茶酚胺刺激，經由β-AR使細胞內AC激活，生成cAMP，這是正常的生理反應。分離過表達VI型AC的轉基因小鼠心肌細胞，發現cAMP表達增高，心功能增強［24］。在起搏誘導的心力衰竭豬模型，轉染攜帶Ⅵ型AC基因的腺病毒，結果顯示可顯著改善心臟功能和逆轉心室重構，且這種效應與cAMP的生成增多具有明顯相關性［18］。
3．心力衰竭基因治療的臨床試驗
篇6
【中圖分類號】R635 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）06-3523-02
老年高血壓是常見的老年慢性疾病，具有腦出血、腦血栓、腦栓塞、心力衰竭、腎臟損壞等多種嚴重并發癥，是老年人致死或致殘的主要危險因素。流行病學調查顯示：我國65歲以上老年人中35%有高血壓，其中67.4%的患者血壓沒有得到較好的控制，因此實現老年高血壓患者平穩、安全降壓，對減少并發癥及死亡具有重要意義。對本文就老年高血壓臨床特點及藥物治療現狀綜述如下。
1 老年高血壓臨床特點：老年患者因病程長、伴發病多、藥物治療種類多而具有以下特點[1-3]：
1.1 單純收縮期高血壓多：
表現為收縮壓升高、脈壓增大，并且隨著年齡增張，單純收縮期高血壓（Isolated Systolic Hypertension， ISH）發病率也在升高。研究顯示：隨著脈壓增大，老年患者心血管事件發生率及死亡率也在升高。
1.2 老年高血壓患者性低血壓及臥位高血壓發生率高：
多由于脫水、失血等誘因、或長期不規律服用降壓藥、抗抑郁藥等相關，治療上更注重糾正誘因、非藥物治療。
1.3 血壓波動大：
血壓“晨峰”現象多，同時易發生餐后低血壓（Postprandial Hypotension， PPH）。
1.4 老年高血壓多病共存情況多：
高血壓病程越長，靶器官受損的機會就越多，與多種疾病共存的機會就越高，如腦血管病（腦出血、缺血性腦卒中）、心臟疾病（心肌梗死、心力衰竭）、腎臟疾病（糖尿病腎病、腎功能受損）等。并且血壓控制不理想，發生率越高。
1.5 難治性高血壓發生率高，且難治性高血壓能加速靶器官損傷。
2 老年高血壓治療
老年高血壓降壓理念已由單純降壓轉為降壓達標。高血壓治療的主要目的是：最大程度地降低心血管病發病和死亡危險。我國指南建議降壓目標值確定為
2.1 利尿藥
利尿劑是臨床上應用最早的降壓手段之一。2011年美國老年高血壓治療專家共識推薦利尿劑是老年降壓治療的一線藥物，而且也是聯合用藥的首選藥物。其作用原理主要是通過減少鈉和體液潴留，降低血容量而使血壓下降。適用于輕、中度高血壓，尤其適宜于老年人收縮期高血壓及心力衰竭伴高血壓的治療，可單獨用，并更適宜與其它類降壓藥合用。但是利尿藥物對于血糖、血脂、及尿酸有影響，對于合并有糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥患者應用受限，長期應用還需檢測電解質，預防電解質紊亂。有研究發現吲達帕胺和托拉塞米除有與普通利尿藥相似的降壓作用外，還有一定的抗鈣作用，是一種新型強長效降壓藥并且對血糖、血脂代謝影響小，尤其適用于左心室肥厚的輕中度高血壓患者，避免了高血糖、高脂血癥限制利尿藥物的應用[5-6]。在老年高血壓患者中，特別是有心腦血管急癥高風險因素的患者中，尤其要注意初始劑量需小，以免過度利尿引起機體脫水，血液高凝，易導致腦心梗等。
2.2 鈣通道阻滯劑
鈣通道阻滯劑（Calcium Channel Blockers， CCB）類藥物作用機制是通過抑制平滑肌L型鈣通道從而降低細胞內鈣離子濃度，使平滑肌松弛，血管擴張從而發揮降壓作用。從結構上分為二氫吡啶類和非二氫吡啶類。CCB由于其降壓治療耐受性好，尤其適用于血管彈性差、左心室舒張功能降低、合并其他心血管異常的老年患者，但是對于心臟傳導阻滯和心力衰竭患者禁用非二氫吡啶類鈣拮抗劑。目前指南推薦長效二氫吡啶類CCB作為老年高血壓患者降壓治療的基本藥物，與其它基本降壓藥物均可聯合使用[7]。該類藥物在老年高血壓患者應用中需注意避免短效、大劑量應用，預防性低血壓的發生。
2.3 β受體阻斷藥
其降壓機制是抑制交感神經，降低心肌收縮力，減少心輸出量，增加左室射血分數，改善心率變異性，增加心力衰竭患者的運動耐量。β受體阻斷藥在高血壓治療中應用存在爭議，日本抗高血壓指南不把該類藥物作為常用藥物，但在歐美及我國，該類藥物仍為基礎用藥，尤其適用于伴有冠心病的高血壓患者。該類藥物在老年高血壓治療應用中需注意，因為老年患者常存在心動過緩、竇房結功能異常、慢阻肺等疾病，臨床應用時需嚴格掌握適應癥，同時應當注意，盡量選擇卡維地洛、美托洛爾等高選擇性長效類β受體阻斷藥[8]。
2.4 血管緊張素轉化酶抑制藥和血管緊張素Ⅱ受體阻斷藥類藥物
血管緊張素轉化酶抑制藥（Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）主要降壓機制表現在兩點：其一就是抑制循環和局部組織中的轉換酶，使ACEI 不能轉變為血管緊張素（Angiotensin type Ⅱ receptor， ATⅡ），從而使血管舒張，降低血壓； 另外就是減少緩激肽的降解，使體內緩激肽水平升高，擴張血管，降低血壓。ACEI不僅具有良好的降壓作用，對高血壓患者的并發癥及一些伴發疾病也有改善作用，尤其適用于伴有心力衰竭、左室肥大、糖耐量減低或糖尿病腎病蛋白尿等合并癥的患者[9-10]。禁用于高血鉀、妊娠、腎動脈狹窄患者。最常見的不良反應是干咳，也是治療中停藥或者換藥的主要原因。
AT1受體拮抗劑（Angiotensin type Ⅱ receptor blockers， ARB）類藥物的降壓及腎臟保護作用與ACEI相似，咳嗽等副作用較少，血管神經性水腫罕見，尤其適用于不能耐受ACEI出現咳嗽等副作用的患者。
2.5 α 受體阻滯劑
α1 受體阻斷劑能選擇性阻斷血管平滑肌突觸后膜的α1 受體，使血管擴張，致外周血管阻力下降及回心血量減少，從而降低收縮壓和舒張壓本類藥物降壓作用明確，對血糖、血脂代謝無副作用為其優點，但可能出現性低血壓耐藥性，使應用受到限制。
3 抗高血壓治療的新技術
3.1 腎臟交感神經射頻消融術
隨著醫學介入技術的不斷發展，在抗高血壓特別是難治性高血壓方面，研究發現經皮導管腎臟交感神經射頻消融術治療頑固性高血壓具有較好的應用前景，同時腎臟交感神經射頻消融術可改善糖代謝和耐藥性高血壓的控制情況[11-13]。腎交感神經射頻消融術是治療頑固性高血壓的技術，在我國幾家醫院已應用于臨床試驗，但由于遠期結果尚不明確，目前在國內只有幾家醫院在專家嚴格把握適應癥的條件下開展，不過相信隨著研究的不斷深入，腎交感神經射頻消融術將會為難治性高血壓提供新的治療策略。
3.2 基因治療
遺傳因素作為高血壓發病的原因之一，基因治療也成為抗高血壓治療的熱點。基因療法包括基因增強和基因抑制兩方面。基因增強就是通過靜脈注射或靶組織局部注射將目的基因轉染到體內，使之表達相應蛋白以達到治療高血壓的目的，此類基因有一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase， NOS）基因、ANP基因、腎上腺髓質素基因、腎素結合蛋白基因等；基因抑制主要采用反義技術和de2coy 技術，對引起血管收縮和高血壓的過分表達的基因采取反義抑制或封閉，抑制復制、轉錄及翻譯，從而抑制引起高血壓的活性蛋白的產生，相關研究主要集中在血管緊張肽原和AT1受體的基因抑制[14-16]。目前動物實驗研究發現基因治療不僅能夠持續穩定降壓，還有可能從遺傳基因層面控制高血壓的發病及家族遺傳。動物實驗研究結果令人鼓舞，但是轉化到臨床應用還有不少問題尚需解決，如靶基因的選擇與界定、安全有效的載體選擇等，還需進一步研究。
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篇7
【關鍵詞】 腺病毒；骨形態發生蛋白2；骨髓基質干細胞；基因治療
BMP2是最主要的骨形成調控因子之一，在體內和體外能夠誘導干細胞分化和骨形成。骨組織工程中應用緩釋技術將BMP2加入載體的方法雖然取得了一些成果，但從理論到技術均有尚不完善之處。本實驗采用體外基因治療策略，將攜帶BMP2基因的重組缺陷型腺病毒表達載體（AdBMP2）轉染骨髓基質干細胞(BMSCs)，檢測BMP2基因表達，觀察基因轉染對BMSCs增殖及成骨分化的影響，探討其作為內源性BMP2的“生物發生器”以及骨組織工程種子細胞的可行性。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 腺病毒載體及細胞 AdBMP2、攜帶β半乳糖酐酶基因的腺病毒對照載體（AdLacz）和人胚腎293細胞，由中國醫科大學附屬盛京醫院骨科李建軍博士提供。通過感染293 細胞擴增病毒，測定AdBMP2滴度為2×1010 PFU·ml-1。
1.1.2 實驗動物 新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質量2.0～2.5kg，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（遼2003-0013）。
1.1.3 主要試劑 DMEM細胞培養基（北京海克隆生物制品有限公司）；胎牛血清（天津灝洋生物制品有限公司）；BMP2單克隆抗體、原位雜交檢測試劑盒和免疫組織化學試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；骨鈣素、Ⅰ型膠原單克隆抗體（Santa Crus公司）；二抗FITC標記IgG（北京中杉金橋）；Xgal（大連寶生物公司）;堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程公司）。
1.1.4 主要儀器 垂直電泳儀（BioRad）；轉印電泳儀（Amersham公司）；可調溫搖床（哈爾濱東聯公司）；臺式低溫離心機（Eppendorf公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；酶標儀（芬蘭雷勃集團MK3）；熒光顯微鏡（日本 Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 兔骨髓基質干細胞培養及轉染 用全骨髓貼壁培養法分離培養BMSCs，2周左右貼壁細胞基本長滿單層，即得到原代培養細胞。按1∶3或1∶4比例分瓶傳代培養。BMSCs（P2）長至基本融合時，更換成含2%FBS的DMEM培養液，細胞計數，根據病毒滴度按感染倍數（MOI）為100（即1個細胞用100個病毒顆粒感染）加入相應體積的AdBMP2，過夜。次日換成含10%FBS的DMEM正常培養液培養2 d。同等條件下AdLacz轉染細胞（MOI=100），Xgal免疫染色檢測轉染效率。實驗組：AdBMP2轉染；實驗對照組：AdLacz轉染；空白對照組：未轉染。
1.2.2 原位雜交、免疫細胞化學染色檢測細胞內BMP2基因表達 取各組細胞，以1×105 ml-1的密度接種于多聚L賴氨酸處理過的蓋玻片上，待貼壁細胞密度達到50%左右時取出蓋玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。分別按BMP2原位雜交、免疫組化試劑盒操作步驟進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，透明，封片，光鏡觀察。
1.2.3 Western blotting檢測培養液中BMP2蛋白 各組細胞換無血清培養液孵育12h，收集培養液20ml，凍干機凍干后加入50μl上樣緩沖液。取10μl樣品，煮沸5min，離心5min，上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（12%SDSPAGE）分離。SDSPAGE電泳在恒壓條件下進行，濃縮膠中為120V，分離膠中為160V。常規轉膜，封閉，然后按膜面積計算一抗用量（0.1ml·cm-2），使用Tween 20PBS按比例稀釋一抗（BMP2單克隆抗體），與濾膜4℃溫浴3h；以TPBS按比例稀釋二抗（辣根酶標記抗體），與濾膜室溫溫浴1h；加入生色底物溶液（PBS 9ml+二氨基聯苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml，最后加入H2O2至0.14%），室溫搖動觀察條帶顏色清晰，PBS終止顯色反應，洗滌，干燥，避光保存。rhBMP2標準蛋白20ng作為陽性對照組。
1.2.4 流式細胞儀分析細胞周期 每組細胞各取6 瓶（1×106瓶-1），胰酶消化收集細胞，用1ml PBS制成單細胞懸液，加入75%冰乙醇4ml固定12h，100μg·ml-1碘化丙啶避光染色30min，震蕩混勻，上機檢測，聯機軟件測定分析細胞周期各時相比例，數據采用SPSS統計軟件處理，方差分析比較。
1.2.5 ALP活性檢測 每組細胞棄去培養液，加100μl 2％Triton100，4℃過夜，按ALP活性檢測試劑盒說明操作，測定吸光度，計算酶活性值。同時設空白對照。計算均數，組間差異用 t 檢驗行統計學分析。
1.2.6 免疫熒光檢測骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原表達 將各組細胞接種于預置有蓋玻片的6孔板內，2周后取出玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。免疫熒光法分別檢測OCN、Ⅰ型膠原表達，0.2% Triton X100透化處理，10% BSA室溫封閉，一抗4℃濕盒孵育過夜，二抗FITC標記IgG室溫避光孵育2 h，PBS漂洗3次，95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察實驗結果。
2 結
果
2.1 AdBMP2轉染BMSCs及轉染率檢測
轉染后細胞形態無明顯變化，邊界清晰，生長旺盛，細胞核較大，呈圓形或橢圓形，胞漿中顆粒較多，隨培養時間延長多角型細胞增多。AdLacz轉染后，細胞可編碼產生β半乳糖酐酶，作用于生色底物Xgal，反應產物呈藍色。與AdBMP2轉染同等實驗條件下（MOI=100），腺病毒轉染效率高達90%以上（圖 1）。
2.2 BMP2基因在BMSCs內的表達
原位雜交及免疫細胞化學染色均顯示實驗組細胞質中有較多棕黃色強陽性染色顆粒（圖 2、3），而實驗對照及空白對照組則為陰性。結果表明：AdBMP2轉染的BMSCs中BMP2基因在mRNA和蛋白水平均呈高效表達。
2.3 Western blotting檢測培養液中BMP2蛋白
Western blotting檢測顯示AdBMP2轉染組有BMP2強陽性條帶，AdLacz轉染組和未轉染組為弱陽性條帶。AdBMP2轉染BMSCs后，分泌的BMP2蛋白含量遠高于實驗及空白對照組（圖 4）。結果表明：AdBMP2轉染的BMSCs中分泌性BMP2蛋白高效表達。
2.4 流式細胞儀檢測細胞周期
分析細胞周期結果顯示，實驗組與實驗對照組及空白對照組的G1期、S期細胞比例無顯著差異（P>0.05），表明AdBMP2轉染后，BMSCs的DNA合成以及細胞的增殖未因轉染受影響(見表1)。表1 細胞周期流式細胞儀分析結果 AdBMP2轉染組ALP活性為(30.21±1.85) U·ml-1，AdLacz轉染組為(19.56±2.09) U·ml-1，未轉染組為(20.65±1.93) U·ml-1，經 t 檢驗分析，AdBMP2轉染細胞組ALP活性較實驗對照組及空白對照組明顯增高，差異有顯著性（P﹤0.01）。
2.6 免疫熒光檢測OCN、Ⅰ型膠原表達
AdBMP2轉染細胞的胞漿內有大量陽性綠色熒光物質（圖5、6），而實驗對照組及空白對照組細胞均為陰性。結果表明，AdBMP2轉染后，細胞內有骨鈣素、Ⅰ型膠原的高效表達，提示BMSCs向成骨細胞表型分化。
3 討
論
BMSCs因其取材方便，易于分離，體外增殖能力強，具有多方向分化潛能，經誘導可成骨分化，是目前骨組織工程中應用最為廣泛的種子細胞。研究表明，單純BMSCs作為種子細胞向成骨分化過程較慢，并非是一個自發的過程，需要細胞因子及特定的體內環境作用，而且成骨分化后細胞表型的維持也需要細胞因子的作用［1］。體內移植后早期細胞外基質形成不足時，植入的細胞也會失去依托和緊密的細胞間黏附，局部的成骨微環境形成將受到阻礙，不能及早確立優勢成骨細胞群而將阻礙成骨。本實驗中也觀察到 BMSCs的ALP活性較低，OCN、Ⅰ型膠原含量少，提示成骨活性較弱。因此，BMSCs需經改造以增強成骨活性才能成為理想的種子細胞。
圖 6 Ⅰ型膠原免疫熒光（×100）
BMP2是被公認最強的成骨誘導因子之一，是調控BMSCs向成骨方向定向分化的主要因子，而且已開始應用于臨床［2］。但BMP2的制備過程復雜，產量低；活性不穩定，在體內環境代謝快，骨誘導時間短；作為外源性蛋白植入體內，用量大時可能會產生毒性反應，還可能引起免疫排斥反應［3］；有報道致力于采用緩釋技術來解決這些缺陷，然而支架材料中能否整合足夠量的BMP2并持續穩定釋放，而且BMP2對理化處理是高度敏感的，在支架材料中能否保持生物活性，成為難以解決的問題［4］。應用基因治療技術可將成骨誘導因子的目的基因導入靶細胞，經過基因修飾的細胞可持續表達細胞因子，可在局部根據需要持續、穩定、靶向釋放內源性細胞因子，促進成骨，并起到維持成骨細胞表型的作用，克服直接應用外源性細胞因子可能產生的上述缺點。
重組復制缺陷型腺病毒因其毒性低、靶細胞范圍廣泛、轉染率高、不與靶細胞發生基因整合等優點，成為基因治療中常用的載體之一。本研究在重組缺陷型腺病毒載體介導下將BMP2基因導入BMSCs，與實驗對照組比較，AdBMP2轉染的BMSCs中BMP2基因在mRNA及蛋白水平呈高效表達，培養液中BMP2含量較高。而且觀察到AdBMP2轉染的BMSCs中ALP活性增強，OCN、Ⅰ型膠原呈陽性表達。ALP活性被認為是衡量BMSCs向成骨細胞方向分化程度和成骨細胞功能狀態的一個重要指標［5］。Ⅰ型膠原蛋白主要由成熟的成骨細胞合成分泌，是成骨細胞的重要標志物之一［6］。OCN是骨代謝細胞分化成熟、處于功能狀態的標志［7］。因此根據實驗結果可以認為，BMP2基因修飾的BMSCs向成骨細胞表型分化，提示BMP2基因的轉染使BMSCs高效表達、分泌的內源性BMP2，通過自分泌或旁分泌增強了自身的成骨活性。BMP2促進BMSCs向成骨細胞分化的機理還不十分清楚，目前認為BMP2并不直接作用于靶基因，而是通過BMP2、受體、信號途徑和靶基因組成的一個較完整的信號系統發揮成骨誘導作用，BMP2處于系統的核心和啟位點［8］。
細胞分化與增殖的矛盾是細胞生物學特征之一，即分化低的細胞增殖能力強，分化高的細胞增殖能力差。本實驗觀察到AdBMP2轉染BMSCs促進了其向成骨細胞的定向分化，但通過流式細胞儀檢測分析細胞周期的結果顯示，AdBMP2轉染的BMSCs的增殖能力并未受影響，與未轉染細胞無差異，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況也證實了這一點。考慮除了與BMSCs強大的增殖能力有關外，可能還與BMP2對BMSCs增殖有促進作用有關。
綜上所述，采用基因技術，通過重組復制缺陷型腺病毒載體介導，可將BMP2基因高效導入BMSCs，基因轉染的BMSCs不僅提供了內源性BMP2的局部來源，而且提供了BMP2自身效應的靶細胞，實現了向成骨細胞的定向分化并保持了強大的增殖能力，有望成為骨組織工程中比較理想的種子細胞。至于基因轉染的BMSCs能否在局部根據需要持續、穩定釋放內源性BMP2，植入體內的轉歸，以及腺病毒載體的安全性等問題尚需進一步研究。
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篇8
基因編輯技術是一項對基因組進行精確定點修飾的技術，可對特定DN段進行敲除、加入和替換等，從而在基因組水平上進行精確的基因編輯。此過程模擬了基因的自然突變，修改并編輯了生物的基因組，使研究人員可以在極短時間內模擬自然界漫長時間的基因演變，甚至能夠完成自然進化中無法完成的基因組改變。在科研領域，該技術可以快速構建模式動物，節約大量科研時間和經費；在農業領域，該技術可以人為改造基因序列，使之符合人們的要求，研制如改良水稻等糧食作物；在醫療領域，該技術可以更加準確、深入地了解疾病發病機制和探究基因功能，以及改造人的基因，達到基因治療的目的等。因此，基因編輯技術具有極其廣泛的發展前景和應用價值。
鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、規律間隔的短回文重復序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因編輯技術。這3種技術皆是通過在特定的靶向序列處引入雙鏈斷裂缺口（doublestrand break，DSB），繼而通過NHEJ途徑（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途徑這2種細胞內DNA修復機制完成修復。NHEJ途徑（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口處有堿基的插入或者缺失，造成移碼突變，導致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途徑在提供外源DNA模板的條件下使基因組DNA得到精確的基因修復或靶向基因的添加[1]。由此可見，這3種基因編輯技術本質上均是利用非同源末端鏈接途徑修復和同源重組修復，聯合特異性DNA靶向識別及核酸內切酶完成的DNA序列改變。
11ZFNs每個鋅指核酸酶單體都是由鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）與非特異核酸酶結合的人工合成酶。此酶的N端部分是能識別含有特定DNA序列的鋅指蛋白，C端部分則由非特異性切割結構域Fok I以及連接DNA結合結構域和內切酶的肽段組成[23]。ZFN的特異性取決于ZFP，因此篩選高質量的ZFP是獲得高效、特異性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6個鋅指組成，每個鋅指識別基因組中連續的3個堿基。ZFP一旦與基因組中的特定序列結合，Fok I核酸內切酶便會形成二聚體發揮內切酶活性，產生DNA雙鏈斷裂的缺口，繼而通過細胞內修復機制對斷裂部位的基因進行修飾[811]（圖1）。ZFN的基因打靶效率一般能夠達到30%，可以做到針對特定序列設計ZFN來實現對靶基因的修飾。然而ZFN識別結構域存在的上下文依賴效應大大降低了ZFN設計和篩選效率。目前尚不能針對任意一段序列均可設計出滿足要求的ZFN，也不能在每一個功能性染色體區段都能夠順利找到適合的ZFN作用位點。在ZFN的篩選和設計方面存在較大的技術困難之外，其制備價格也比較昂貴。此外，ZFN的脫靶切割也往往會導致細胞毒性。綜上這些因素使得ZFN在基因治療領域的應用有一定的局限性。
12TALENsTALEN是植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas sp.產生的TALE蛋白的中央區域結構域與FokⅠ核酸內切酶結構域組合而成的一類重組核酸酶。TALE蛋白的中央區域結構域是該蛋白識別特異DNA序列的結構域。它包含了155～195個蛋白單元模塊，每個模塊單元有34個氨基酸殘基，其中除第12和13位氨基酸可變外，其他氨基酸都是保守的。因此，這第12和13位氨基酸被稱作重復可變的雙氨基酸殘基（repeat variable diresidues，RVDs） 位點[12]，是靶向識別的關鍵。由于TALE存在多種變體，所以可以構建出靶向基因組中預設DNA靶位點的多種TALEN。相比ZFN技術，TALEN使用了TALE蛋白的中央區域結構域代替ZFP作為人工核酸酶的識別結構域，更好地解決了DNA序列識別特異性低的問題。TALE蛋白中央區域結構域對堿基的識別只由2個氨基酸殘基決定：組氨酸天冬氨酸特異識別堿基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺異亮氨酸識別堿基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸識別堿基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺識別堿基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺賴氨酸識別堿基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺絲氨酸可以識別A，T，G，C 中的任一種NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（圖2）。這種與DNA堿基一一對應的方式在設計上相對于ZFN要簡單得多。然而，在實際構建過程中，TALE分子的模塊組裝和篩選過程也比較繁雜，通常需要大量的測序工作。這使得該技術的使用成本較高，對于普通實驗室的可操作性較低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效導入細胞方面也限制了它的應用。
13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系統是在細菌和古細菌中發現的一種獲得性免疫系統[15]，由成簇的、規律間隔的短回文重復序列CRISPR與Cas蛋白組成，能特異性識別外源病毒或質粒的核酸物質，并對其進行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通過轉錄生成一段非碼RNA，即CRISPR前體
的靶標可設計為針對一個基因，也為針對多個基因，都能達到有效的特異性位點編輯的效果。CRISPR/Cas9系統已被公認為是繼“鋅指核酸內切酶（ZFN）”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）”之后出現的第3代“基因組定點編輯技術”。ZNFs和TALENs作用時均是采用蛋白質對DNA序列的識別，而CRISPR/Cas9對靶序列的識別是RNA與DNA的堿基配對過程。該識別方式使得CRISPR/Cas9與前二者相比更為精準，降低了脫靶切割的幾率，減低了細胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通過導入質粒進行表達，因此也省去了耗時耗力的蛋白質工程過程。同時，研究人員可以通過生物信息學分析，設計出針對絕大多數基因的特異性靶標識別crRNA。因此，與前2代技術相比，CRISPR/Cas9成本低、制作簡便、快捷高效、脫靶率低的優點使其迅速風靡于世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具，逐漸成為當今分子生物學領域最炙手可熱的技術之一。然而CRISPR/Cas9 系統也存在著一些不完美之處：Cas9 蛋白對于目標序列的識別除了依靠crRNA序列的匹配之外，目標序列附近必須存在一些小的前間區序列鄰近基序（PAM），因此Cas9 蛋白對于設定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技術一樣，CRISPR/Cas9也面臨著如何控制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復可能會隨機產生細胞毒性的問題。
14 NgAgoCRISPR是以RNA為向導尋找靶向序列，而NgAgo則是以DNA來擔任向導。韓春雨等的工作顯示，NgAgo可結合24個堿基的gDNA，比CRISPR結合19個堿基的gRNA要長5個堿基，因此理論上精確性要高1 024倍，脫靶率也較低。然而，不同于CRISPR/Cas9技術大量運用已獲得了實踐驗證，NgAgo的作用效果還有待于今后工作的檢驗。
2基因編碼技術的應用
21在基因治療中的應用隨著DNA雙螺旋結構的發現和以DNA重組技術為代表的現代分子生物學技術的發展，以及人類對疾病認識的不斷深入，越來越多的證據表明，許多疾病都與基因突變、缺失或表達異常有關，由此基因治療技術順勢而生。基因治療是指應用基因工程技術將正常基因或有治療作用的基因引入患者細胞內，以糾正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通過細胞內基因修飾來治療疾病。近兩三年來，基因編碼技術作為該策略的新生力量開始活躍在基因治療的舞臺上，在癌癥、遺傳性疾病和逆轉錄病毒相關的傳染病等疾病的治療方面取得許多堪稱跨時代的佳績。
癌癥治療方面：2015年11月英國倫敦大奧蒙德街醫院（Great Ormond Street Hospital）的醫生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的療法，成功地治愈了一名患有“無法治愈的”白血病的1歲女孩“萊拉”（Layla）。其治療方案是利用TALEN蛋白對異體T細胞進行基因編輯，去除內源性TCR（提高腫瘤殺傷特異性）及CD52（避免藥物alemtuzumab的干擾），并命名為antiCD19 CART細胞，再將這些經過設計的“人工培育的免疫細胞”輸入患者體內去捕捉和殺傷腫瘤細胞。經過1個月的治療，這名女孩目前擺脫了癌癥，身體狀況很不錯，成為世界上首次用基因編輯治愈的白血病女孩[18]。此外，科學家們在過去的幾十年中已經確定了許多腫瘤治療中相關的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因組修飾類、基因抗藥性基因。近2年，研究者們已經開始利用基因編碼技術對上述基因開展了大規模的基因編輯修飾研究，預計今后幾年內會出現多項癌癥治療方面的重大突破。
遺傳性疾病治療方面：2015年底《Nature》雜志發表的對2016年熱點研究領域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美國加利福尼亞州里士滿Sangamo生物科學公司將計劃開展利用ZFN糾正導致血友病基因缺陷的人體試驗，并對其研究成果表示非常期待。另外該公司還與馬薩諸塞州劍橋市的Biogen公司合作開始了另一項試驗，嘗試通過該技術提高β地中海貧血患者體內一種血液球蛋白的功能[19]。已有研究證實人β珠蛋白（HBB）基因的突變可能導致地中海貧血癥。我國中山大學黃軍就和他的團隊利用CRISPRCas9基因編輯技術，修改了人類胚胎HBB基因的DNA，為治療地中海貧血癥提供了可能。該研究中一共使用了86個胚胎，48 h后有71個胚胎存活，其中在54個接受了基因測試的胚胎中僅有28個胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遺傳物質。該研究是史上第一例利用基因編輯技術改造人類胚胎細胞的案例。盡管該研究使用的胚胎均為無法發育成嬰兒、不能正常出生的胚胎，該成果的倫理問題在西方仍引發巨大爭議，由此《Nature》的記者和編輯們最終將黃軍就選入了年度十大人物之列[20]。多種肌肉營養障礙癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表達dystrophin蛋白的基因發生移碼突變，導致不能形成有功能的抗肌萎縮蛋白dystrophin所引發的一種遺傳性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技術成功修復了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南醫學中心的Chengzu Long，杜克大學的Charles Gersbach，哈佛大學Amy Wagers 與MIT張鋒合作研究組這3個獨立的研究組又分別完成了小鼠成年體的基因修復。其中Chengzu Long研究組的研究方案為利用腺病毒將gRNA以及CRISPR/Cas9導入肌肉細胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能夠產生較短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。
逆轉錄病毒相關傳染病的治療方面：HIV病毒的基因會整合到病人的基因組上。利用抗逆轉錄病毒藥物治療僅能抑制HIV病毒的復制但對整合在細胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用藥物這些病毒余孽就會起死回生，開始產生艾滋病原體。因此只有清除整合在宿主靶細胞上的HIV病毒基因才能實現根治艾滋病的夢想。2013 年，朱煥章等設計并獲得了一對能特異靶向多數HIV亞型基因保守區LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并證實該ZFN能特異性靶向HIV感染及潛伏細胞系上的HIV1前病毒LTR，且介導了HIV1整合基因的高效切除，畝獲得了顯著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技術使帶有HIV病毒的T細胞失去活性，同時病毒復制在受感染細胞中降低了90%。這一治療方案預計在兩三年后開展臨床試驗。
22在新方法學及動物模型制備上的應用當前，各類基因敲除（knockout）和基因嵌入/置換（knockin）基因工程動物及細胞系已經成為現代醫學認識疾病發生發展規律、研究疾病預防和治療的重要實驗工具和手段。傳統的基因工程動物制備工藝――基因打靶技術是基于胚胎干細胞的一種同源重組技術。利用該技術制備基因修飾動物周期較長且存在生殖系統傳遞失敗的風險。新型的基因編碼技術系統可在小鼠受精卵中直接進行基因組編輯，因而快速、高效、低成本、無物種限制地一步生成基因工程動物。復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室的研究人員通過CRISPR/Cas9技術進行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）基因敲除，快速、高效地構建血友病乙模型小鼠，以期為血友病乙的研究提供更加便捷的途徑[24]。Park 等[25]使用TALEN 技術將誘導的多能干細胞中含有F8 基因的140 kb染色體片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通過TALEN基因編輯工具將其之前倒置的染色體片段再重新恢復到正常。實驗結果表明TALEN基因編輯工具既可以建立疾病模型，又可以介導疾病的再次糾正。軍事醫學科學院的研究人員利用CRISPR/Cas9介導的同源重組，將有絲分裂降解結構域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到進基因組表達框上游，以期周期性持續降解細胞內CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，從而獲得CTCF蛋白特異性降解細胞系，為后續研究CTCF功能奠定基礎[26]。
此外，隨著現代生物技術的不斷發展和完善，基因編輯技術已經變為科研人員的新寵，越來越多的科學家運用其與其他技術相結合進行各種學術研究。第三軍醫大學西南醫院和重慶大學的研究人員通過CRISPR/Cas9介導的同源重組修復方法，用GFP標記HCC細胞中的內源多功能性因子Nanog，證明雄激素/雄激素受體軸可以通過直接結合其啟動子，增加Nanog的表達，并促進HCC細胞的干性和腫瘤發生[27]，從而初步闡明了肝癌發生的性別差異的機制。CRISPR/Cas9技術的成熟使得利用多重sgRNA載體高效、高通量編輯細胞內基因成為可能，為新型功能遺傳篩選創造了條件。IAA2（indole acetic acid 2）是擬南芥Aux/IAA生長素響應基因大家族中的一員。由于沒有該基因的失去功能型突變體，其功能和作用機制的研究受到了阻礙。研究人員在GoldenGate克隆技術的基礎上，將每3個sgRNA串聯到同一個入門載體中，再將入門載體與含Cas9表達框的目標載體LR反應，獲得最終的表達載體。結果表明，設計的6個sgRNA有4個發揮了作用，產生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變，所得到的突變體為后續的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。
23其他應用前景目前，世界各地的實驗室已將基因編輯技術應用于生物學研究的各個領域。
預防瘧疾：利用CRISPR/Cas9對蚊子的基因進行改造，使其攜帶一種抗瘧疾的基因，從而對瘧原蟲產生抑制，進而遏制瘧疾的傳播[29]。另一種改造為導入不孕基因，使瘧蚊滅絕[30]。
器官移植：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對豬胰島素基因進行了無痕定點修飾，使豬胰島素基因編碼生產人胰島素，成功建立了完全分泌人胰島素的基因編輯豬。這為糖尿病人提供更為理想的臨床異種胰島移植供體。另外，有研究改造了豬肺基因以利于用于人體肺移植，以及去除了豬器官上的內源性逆轉錄病毒（PERV）以防止移植器官帶來的病毒感染[31]。
生物制藥：北京蛋白質組研究中心張普民教授及其研究團隊利用CRISPR/Cas9技術對豬受精卵的基因組進行了基因編輯，在豬白蛋白的基因區域插入了人白蛋白的編碼DNA，使豬只產生人白蛋白而不產生豬白蛋白[32]。
農業育種改良：利用CRISPR/Cas9技術幾年內可實現至少50～100年才能完成的育種改良工作。圣保羅Recombinetics公司利用該技術培育出不會長角的牛，從而使牛無須經歷被切去牛角的痛苦過程。目前該公司正致力于培育永遠不需要被的豬。
滅絕物種復活：加州大學圣克魯斯分校Ben Novak將滅絕的候鴿的博物館標本DNA與現存鴿子進行序列比對，并嘗試對現存鴿子進行基因改造，使這些鴿子變得更接近滅絕的候鴿。
3基因編碼技術的爭議與思考
基因編輯技術可謂當今生命科學界炙手可熱的前沿科技。顧名思義，該技術能夠對最基本的遺傳單位――基因直接進行設計和修改，其意義和價值可想而知。這使得各大公司迅速加入到基因編輯的產業之中。2015年8月，比爾及梅林達?蓋茨基金會和谷歌風投基金投資Editas醫藥公司1.2億美元；2015年10月杜邦與Caribou生物科學公司達成了合作協議，使用CrisprCas9技術來改進農作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中國基因編輯技術產業已走在世界的前列：在CRISPR技術數上中國僅次于美國，位居世界第2；目前50多家中國研究機構已提交了基因編輯專利；勁嘉股份與黃軍就團隊合作開展CRISPR技術治療地中海貧血在臨床應用方面的研究。中泰證券的分析師認為未來5年僅地中海貧血基因治療的國內潛在市場空間超過500億元。與此同時，隨著基因編碼技術的不斷發展，CRISPR/Cas9系統相對前兩代技術效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，構建周期縮短至原來的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脫靶率依據最新技術已降低至目前檢測技術檢測不到的水平。脫靶率、效率、便攜性及成本的極大改善，使得該技術更平民化，技術門檻越來越低。它已成為許多車庫生物學家/草根生物學家以及生物黑客的新寵。都柏林生物黑客和企業家Andreas Stürmer說，CRISPR是有史以來最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。
但任何事物都有其雙面性，基因編輯技術產業雖然能夠造福于人類，然而上面所述的巨大的經濟利益驅動以及越來越低的技術門檻，再加上人類對自身健康改良的迫切心態極可能導致對該技術的濫用，進而對人類和地球環境形成威脅，甚至造成意想不到的生態災難。在美國國家情報總監詹姆斯?克拉珀的威脅評估報告中，“基因編輯”已經被列入“大規模毀滅性武器和武器的擴散”威脅名單，與核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，關于該技術運用的爭議從其誕生之日就已出現，并呈愈演愈烈之勢。現有爭議最集中之處為關于人類胚胎改造的倫理學爭議。史上第一、二例基因編輯技術改造人類胚胎細胞的研究皆出現在中國。2015年4月，中山大學黃軍就和他的團隊利用CRISPRCas9基因編輯技術，為治療地中海貧血癥修改了人類胚胎基因組[33]。2016年4月29日廣州醫科大學范勇團隊，宣布他們用基因編輯技術制造出一個能對艾滋病毒免疫的人類胚胎[34]。盡管這2例基因編輯研究都使用的是人類三核受精卵（不能正常發育的受精卵），但在國際上仍引起了廣泛的關注和全球科學家激烈的討論。討論的焦點不在于文章的學術價值，而在于改造人類胚胎細胞的倫理問題。由于基因編譯技術引發的倫理問題迫在眉睫，2015年12月1日，由美國國家科學院、美國國家醫學院、中國科W院和英國皇家學會聯合組織召集的人類基因組編輯國際峰會在華盛頓召開。會議重點了解各方對基因編輯技術的倫理問題的態度和想法。美國再生醫學聯盟主席蘭菲爾（Edward Lanphier）等在《Nature》雜志上發表評論文章稱，希望研究人員暫時不要對人類生殖細胞進行基因編輯，否則可能對后代產生無法預測的后果[35]。然而，人類胚胎改造的研究終究為大勢所趨。2016年2月1日，英國政府批準了倫敦弗朗西斯?克里克研究所 Kathy Niakan研究員對人類胚胎進行編輯的請求。這項研究成為世界首例獲國家監管機構批準的人類胚胎編輯研究。
綜上所述，日漸成熟的基因編輯技術已經成為了強力的生物、醫學工具，在癌癥、遺傳性疾病和逆轉錄病毒相關的傳染病等疾病的治療方面帶了巨大的突破，可以快速構建實驗新方法和動物模型，推動科研的發展，并在器官移植、生物制藥、農業育種改良、滅絕物種復活和中藥現代化等方面具有廣闊的應用前景。其價值甚至引起了普通民眾的廣泛關注。人類暢想將來它不僅可去除遺傳缺陷、治療疾病，還可導入長壽、健康、強力的基因，甚至制造完美人類。當然，任何事物都是一把雙刃劍，在樂觀暢想基因編輯技術可使人類變得更加完美的同時，也不要忘記濫用技術可能帶來的潛在風險和生態災難。建立針對基因編輯技術安全有效的檢測手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使這項技術更好地應用和造福人類。
4基因編輯在中藥發展中的潛在前景
如何讓傳統中藥跟上生命科學現代化的步伐，使傳統中醫藥走出國門，讓世界接受中草藥，是當今中醫藥工作者面臨的難題。長期以來，由于中醫藥與現代醫學、生命科學之間缺乏有效溝通的橋梁，有逐漸被邊緣化的趨勢。中藥基因組計劃將現代生命科學的最新技術和研究成果應用于中藥研究，有望徹底改變中藥研究手段和方法的落后局面，架起傳統中醫藥學與現代生命科學之間溝通的橋梁。中國中醫科學院中藥研究所陳士林團隊在著名植物學雜志《Molecular Plant》發表丹參全基因組[36]，標志著作為常用中藥丹參的遺傳密碼被破譯，為揭示丹參主要藥理活性成分丹參酮和丹參酚酸生物合成及其調控的分子機制，促進丹參優良品種選育提供了重要的遺傳背景基礎。該工作構建了世界上首個藥用植物基因組框架圖，標志著我國中藥研究進入了基因組學時代。目前已有多個中草藥如印度大麻、赤靈芝、牛耳草、鐵皮石斛等完成了基因組測序。中草藥基因組研究的飛速發展為基因編輯技術在中草藥研究中的應用帶來了極佳的時機和廣闊的前景。今后研究者們可以以丹參研究為模板，借鑒國外的植物基因組研究計劃的經驗，對中草藥在結構基因組學、功能基因組學和生物信息學等方向展開研究。在此基礎上，利用基因編輯技術開展中藥藥效成分、藥材的生長及抗性相關基因的研究和改造工作，結合先進的育種方法，篩選出既保持“道地血統”，又優質、高產、抗病的中藥材優良品種。該工作既有利于實現中藥標準化生產，使中藥質量可控，又有利于解決當前中藥材資源面臨的“斷糧”困境。
中藥藥材是現代藥物研發最大的遺傳信息資源之一。我國在該方面具有得天獨厚的優勢。《本草綱目》中記載了1 892種藥用植物，1995年出版的《中華本草》收集了8 000多種藥用植物，而且其中不乏很多名貴，稀缺的藥材如人參，蟲草等。另有統計表明，我國中草藥已有12 000多種。基因編輯技術的成熟也為開發這個藥物基因資源帶來了良機。基因編輯技術在中藥資源的引入和應用，將會為解決這一問題帶來新的前景。通過基因編輯技術可以快速獲得藥材靶基因的突變或是導入異源基因，從而快速鑒定出該基因產物與藥理活性成分的相關性和重要性，發掘出新的或更高效的藥物相關基因，并可更清晰地闡明藥理活性成分生物合成及其調控的分子機制。
盡管將基因編碼技術引入中藥研究能為傳統中草藥帶來新發展和突破，但與當今各個領域廣泛應用基因編碼技術相比，其在中藥研究中的應用還處于起步階段，還有許多基礎工作有待完善。比如這一技術的應用必須以完善的中藥基因資源為基礎，如果沒有對中藥特別是具有豐富藥理藥效學和臨床應用價值的名貴中藥的基因資源的研究與開發，基因技術體系的應用必然大打折扣。此外，也不能盲目的為了中藥的基因而基因，浪費大量的人力物力資源，應有的放矢的將目標集中在既具有重要臨床應用價值的名貴或瀕臨滅絕的中藥基因資源的研究與應用上，為中藥現代化搭建良好的基礎技術平臺，讓現代基因技術更好的為傳統中藥的發展服務。
[致x]李連達院士對本文的選題、框架設計等給予了諸多寶貴意見。
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篇9
【關鍵詞】 快速成型；膝關節模型；CT；DICOM
【Abstract】 This paper has reviewed the clinical practice situation in medical science about rapid prototyping technology. Described rapid prototyping technology general step and clinical practice situation that the ankle bone rolls over . Getting CT image picture of the whole knee joint with spiral CT， it is 1.0mm to scan one slice of intervals. Use DICOM file as the data source and get two-dimensional CT image of the knee joint through the relevant software. Using figure software edit and get shin bone fracture border of knee joint then export the border curve to CAD system and set up the three-dimensional model and export STL file again from CAD system； Paper base model that the ankle bone converts into tibi outside adopting the laser rapid prototyping machine of Model ZSW-I-A and processing STL file into the shin bone. Have used this paper base model on clinically and have got comparatively ideal results.
【Key words】 rapid prototyping；knee joint model；CT；DICOM
快速成型技術是將計算機輔助設計CAD，計算機輔助制造CAM，計算機數字控制CNC，激光，精密伺服驅動系統和新材料等先進技術集于一體，依照計算機上構成的產品三維設計模型，對其進行分層切片，得到各層截面的輪廓。按照這些輪廓，激光束選擇地切割一層一層的紙基（或固化一層層的液態樹脂、燒結一層層的粉末塑料），或噴射源選擇地噴射一層層的粘結劑或熱熔材料等，形成各截面輪廓，并逐步疊加成三維產品，從而獲得所需的模型或產品的方法［1］。人膝關節是人體最主要也是最重要的關節之一。由于其在臨床醫學、康復工程、生物機械工程等領域的重要研究價值和應用前景，長期以來吸引了大量的生物力學研究者投入對其的研究［2～6］。利用精確的物理模型可直接用于膝關節的移植和矯形手術，可以以原型為模具，用傳統方法做替代膝關節或矯形器械；另一方面可采用生物活性或生物兼容性材料制成的原型直接植入人體，與合金制品相比，具有更好的生物兼容性。其具體的優點是生產周期短；人工骨與被代替骨形基本一致，有利于保持與原有其他器官的匹配；人工骨內部具有微孔結構，組織液和骨細胞容易長入，促進修復過程；在人工骨內部有骨因子，可使人工骨很快與人體微循環組織連通［7，8］。
1 三維模型的重建
制作膝關節模型的技術工作流程是：三維重建原型加工快速模具膝關節模型澆注后處理（見圖1）。
2.2 假體工程 膝關節模型的制作可以為臨床醫學中的“量身定做”問題的解決提供較為有效的解決方法和制作手段，適用于整形外科和假體工程，將RP和CT、MRI技術結合能輔助外科醫生迅速準確地實施復雜外科手術，制作膝關節修復體，輔助正畸等。運用膝關節模型，設計師可以根據特定病人的CT或MRI數據而不是標準的解剖學幾何數據來設計并制作種植體，這樣就極大地減少了種植體設計的出錯空間，并且這種適合每個病人解剖結構的種植體確實能設計一個更好的手術結果。能制作出與病人完美配合的種植體，這一點可幫助外科醫生大大縮短手術操作的時間。這不但讓病人減少了麻醉時間，還能減少費用。由于有了解剖模型，醫生可以有效地與病人溝通，借助于病人自己的解剖模型，可以指出關鍵的區域，從而增加病人的理解。
3 結論
通過快速原型加工的脛骨骨折紙基模型在臨床的應用研究，可以得到如下結論：（1）以DICOM文件為數據源的三維建模方法可以得到比較準確的膝關節三維模型。（2）將膝關節紙基模型用于診斷和手術可以大大縮短手術時間，提高手術的質量，增加手術成功率。（3）膝關節紙基模型為母模可以制作出與患者膝關節面匹配良好的修復假體。
4 展望
隨著基礎科學研究和邊緣學科研究的進展，骨科的臨床實踐正在發生明顯的改變。特別是基因研究的深入，將來可以通過功能基因組學等技術早期診斷疾病從而及早采取預防措施。骨科疾病的基因治療目前多限于動物模型，但是已有多項關節炎臨床試驗正在進行之中［10～12］。納米技術的發展為仿生材料的臨床應用創造了條件［13］。在不久的將來，金屬及塑料材料的應用將會減少，取而代之的是有細胞活性的生物材料［7，8］。現在，快速成型的技術正朝著精密化、高精度、標準化、低成本等方向發展，并且可以實現真正意義上的綠色制造［14］。采用生物材料作為原材料直接成型的個性化假體將是RP技術在醫學領域中的發展趨勢。
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篇10
[中圖分類號]R978[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210（2007）11（a）-028-03
乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)性肝炎是嚴重危害人民健康的常見傳染病。自1964年被發現后的40多年里，它成為了無數人揮之不去的陰影。全世界乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陽性者約4億人，主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲地區[1]。據統計，全球每年約有100萬人死于HBV感染相關性疾病，占疾病死亡原因的第9位[2]。我國HBsAg陽性者約有1.2億人，其中3 000萬人為慢性乙肝患者[3,4]。如何預防和有效治療肝炎成為當今重要的醫學課題。現將目前常用的治療乙型肝炎的現代藥物及臨床應用作一綜述，供醫患參考。
1 生物類藥物
1.1 干擾素-α
IFN-α結合于其特異的細胞表面受體，誘導細胞表達多種廣譜的抗病毒蛋白，包括蛋白激酶A(protein kinase A , PKA)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylate synthetase, OAS)、脫氨酶(adenosine deaminase, ADAR) 和Mx蛋白等。PKA可被細胞內病毒RNA激活, 隨后使翻譯起始因子-2α(eukaryoteinitiation factor-2α,eIF-2α)磷酸化而失去活性，從而阻止病毒mRNA的翻譯，使病毒蛋白合成起始受阻；OAS在細胞內被病毒單鏈RNA激活，合成寡腺苷酸，繼而激活細胞內RNA酶L，病毒RNA降解；ADAR可催化病毒雙鏈RNA中的腺嘌呤轉變為次黃嘌呤，從而使病毒解聚。Mx蛋白是一類蛋白家族，可影響細胞內病毒核殼體的轉運及RNA的合成[7]。此外，IFN-α通過免疫機制抗HBV[8]。對HBeAg陽性患者的療效, IFN-α治療3~6個月，停藥6~12個月后，HBeAg轉陰率為33%，血清HBV DNA轉陰率為37%，HBsAg轉陰率為8%。對于HBeAg轉陰的患者，其療效一般會長期維持。有研究表明，HBeAg轉陰患者中80%~90%在4~8年內其HBeAg持續陰性[9]。長期的臨床隨訪(7~10年)研究表明，IFN-α治療可顯著改善HBeAg轉陰患者的預后，其肝硬化并發癥及肝移植發生率顯著降低，累積生存率顯著提高[10]。目前，臨床試驗又應用新一代的聚乙二醇-IFN-α(PEG-IFN-α)治療乙型肝炎，并取得了不錯的療效[11]。
HBeAg陰性的CHB患者，其體內感染的HBV DNA的前核心區發生了突變，從而不能表達HBeAg。這類患者對IFN-α的反應性比HBeAg陽性患者差，有報道顯示，以HBV-DNA轉陰和轉氨酶水平恢復正常為標準，其IFN-α治療的長期有效率僅為15%~18%[12]。對HBeAg陰性患者采用IFN-α治療24個月，治療結束21個月后，其有效率為30%。HBeAg陰性患者IFN-α治療后，持續應答者發生肝硬化及其并發癥的幾率和死亡率與治療無效，治療后復發與未治療者相比明顯降低[13]。
1.2 胸腺肽α1
胸腺肽α1(thymosin alpha-1, Tα1,Zadaxin)是20世紀70年代末期從胸腺素第5組分(TF5)中分離純化出的一種小分子生物活性多肽。Tα1分子含28個氨基酸, 廣泛存在于機體的胸腺上皮細胞、外周血、大腦、垂體、、濾泡液和羊水中。Tα1在機體免疫應答過程中充當十分重要的角色，其抗HBV的作用機制尚未明確，目前認為可能和增強T細胞及NK細胞應答功能及增強IL-2及IFN產生有關。
Chan HL[14]等實驗證明，胸腺肽組與安慰劑組相比治療結束，治療結束后6個月、12個月生物化學反應無差異。結論認為，對于慢性乙型肝炎病毒感染胸腺肽能有效抑制病毒復制，但此影響延遲直至停止治療后12個月。現有劑型為注射劑，療程6個月，基本和干擾素相似，無任何副作用。胸腺肽α1還可以作為疫苗輔助藥來加強乙肝疫苗的效果，其作用特點表現為延遲效應。在治療結束時對胸腺肽α1的效應率很低，但隨訪觀察中完全效應的病例逐漸增加。單用胸腺肽α1治療的效應率不高，主張與其他抗乙肝病毒藥物聯合應用。
2 化學類藥物核苷類似物
2.1 拉米夫定(lamivudine,3TC)
拉米夫定是新型核苷類藥物，全稱2',3-二脫氧-3-硫代胞嘧啶(3TC)。其進人細胞后，磷酸化為三磷酸拉米夫定而發揮作用。拉米夫定作用的靶位是HBV聚合酶反轉錄活性YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、門冬氨酸)基序。在HBV復制周期中，HBV侵入細胞內，其核心部分進入胞核，部分雙鏈的環狀DNA分子轉變成超螺旋共價閉合環狀DNA(cccDNA)，然后合成前基因組RNA，再以此為模板在HBV聚合酶作用下反轉錄負鏈DNA，最后復制成部分雙鏈的環狀DNA，HBV聚合酶的抑制將抑制前基因組RNA反轉錄為負鏈DNA，阻斷新合成HBV-DNA的鏈化，從而抑制HBV的復制。 拉米夫定可快速高效抑制HBV-DNA復制。香港、臺灣等地的雙盲、安慰劑對照研究[15]發現，每天100 mg拉米夫定口服治療2周，病人血HBV-DNA比基礎值下降97%。每天100 mg拉米夫定治療52周和安慰劑的HBV-DNA陰轉率(
拉米夫定特異性抑制HBV聚合酶反轉錄活性部位，故毒性極低。迄今為止的臨床試驗中不良反應的發生率及嚴重程度和安慰劑組相比無顯著性差異，試驗病人耐受良好。在臨床前動物實驗中，使用大于臨床治療劑量幾十和幾百倍的拉米夫定對大鼠、貓和狗的主要器官無毒性。拉米夫定治療中存在的問題：停藥后反跳，膽紅素升高。長期拉米夫定治療，隨著敏感株迅速被抑制，耐藥株會逐漸出現。對拉米夫定耐藥的HBV突變主要是HBV聚合酶C區的酶活性區YMDD基序的變異，其中蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代。YMDD突變株的復制能力低于野生株[17]，因此，繼續應用拉米夫定，HBV-DNA的回升往往低于治療前的水平，一般不出現臨床病情加重或惡化。
2.2 阿德福韋(adefovir)
阿德福韋酯在體內迅速完全代謝為母體藥物阿德福韋，在細胞激酶作用下磷酸化為活性代謝產物二磷酸鹽-PMEApp，此產物與酶的自然底物三磷酸脫氧腺苷(dATP)競爭，抑制HBV-DNA聚合酶(HBV逆轉錄酶)或通過整合到病毒DNA鏈后使其發生鏈終止；PMEA本身也可直接整合到HBV-DNA鏈中，形成DNA鏈終結子[18]，使HBV-DNA鏈停止復制，因而它具有較強的抑制HBV-DNA復制的作用。在為期48周的隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗(序號分別為437及438)中阿德福韋口服劑量為10 mg/d (n=700)[19,20]。試驗結果表明，437研究中治療組與對照組發現肝活檢病理改善率分別為53%和25%，血清HBV-DNA對數值分別下降lg(3.57±1.64)和lg(0.98±1.32)，ALT正常率分別為48%和16%。438研究中治療組與對照組發生肝活檢病理改善率分別為64%和35%，血清HBV-DNA對數值分別下降lg(3.65±1.41)和lg(1.32±1.25)，ALT正常率分別為72%和29%。HBeAg陰轉率在437研究中分別為12%和6%，繼續給藥阿德福韋至72周，在此期間HBV-DNA下降程度同前48周的治療期相同。同時437研究中ALT正常率增加，肝移植病人的臨床試驗中也取得相似療效。雖然拉米夫定是抑制HBV的有效的核苷類似物，但在長期應用之后，病人經常出現耐藥性，并且隨用藥時間的延長發生耐藥性的比例增加，導致其療效明顯降低[22]。阿德福韋對于拉米夫定耐藥病毒株有顯著的抑制作用[23]。在迄今為止的實驗中，阿德福韋顯示了良好的安全性及有效性。
2.3 恩替卡韋(entecavir)
恩地卡韋為新型碳環2-脫氧鳥苷，在體內在磷酸激酶的作用下形成活性的三磷酸化合物，拮抗HBV所需要天然底物脫氧鳥苷三磷酸（dGTP），在細胞內作用半衰期為15 h，在人體內不被肝細胞代謝，主要從腎臟排出。恩地卡韋的作用靶點為HBV的逆轉錄酶，可以在所有3個環節抑制HBV逆轉錄酶活性，包括堿基引導（base priming）、從mRNA前體反轉錄成負鏈以及HBV-DNA正鏈合成。
在體外HBV-DNA轉染的HepG32細胞的藥物抗HBV實驗中發現，它是現有抗HBV核苷類似物中作用最強的一種。其抗HBV作用大于LAM 1 000倍，并可降低肝組織中cccDNA量和病毒抗原量。不但對野毒株具有顯著抑制作用，而且對基因突變株也具有同樣的抑制作用，并且對拉米夫定、泛昔洛韋的耐藥病毒株仍然敏感。美國FDA公布的資料表明[24]，對于核苷類似物處治者，無論HBeAg陰性還是陽性，治療48周后，恩地卡韋治療組患者的組織學改善比率均顯著高于拉米夫定對照組；HBV-DNA較基線的降低幅度以及血清ALT復常率，實驗組均顯著優于對照組[25]。Wong等[26]對Ⅲ期臨床研究組的部分病例進行了肝細胞內HBVcccDNA的檢測，初步結果顯示治療48周后恩地卡韋降低肝細胞內HBVcccDNA的作用強于拉米夫定。國內外對恩地卡韋的臨床研究結果相似，在未經抗病毒治療的患者中，總的不良時間發生率為：恩地卡韋0.1 mg組45%、恩地卡韋0.5 mg組40%，安慰劑組42%，無1例發生藥物相關的不良事件[27]。
基本適應證為有HBV活動性復制和血清學或肝組織學炎癥指標的成年慢性乙肝患者。其療程在1年以上，目前對停藥指征尚無明確規定。治療期間和停藥后密切監察和隨訪[28]。
2.4 其他
其他抗HBV病毒的核苷類似藥物還有泛昔洛韋( famcictovir)、利巴韋林(ribavirin) 、阿糖腺苷(Ara-A)、單磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)，它們通過作用HBV復制不同的階段來抑制病毒。在臨床驗證的核苷類似物新品種還有替諾卡韋(tenofovir）、特必夫定(telbivuding)、克來夫定(clevudine)和恩曲他濱(emtricitabine)等，它們比拉米夫定有相同或更高的抗病毒效果，而且對拉米夫定耐藥株有效。
3 免疫調節藥物
3.1 胸腺因子D
胸腺因子D 對HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg和HBeAg有劑量依賴的抑制作用。對HBsAg的抑制效果要優于對照藥物IFNα-2b，對HBeAg的抑制效果要略低于對照藥物IFNα-2b。現在發現熱休克蛋白gp90或它的N-末端片段注入乙肝患者，細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應答加強，顯示其可能通過增加CTL免疫應答增加機體抗乙肝病毒和原發性肝癌的能力[29]。
3.2 樹突狀細胞(dendritic cell,DC)疫苗
樹突狀細胞作為抗原提呈細胞在激發抗病毒免疫應答中起著重要的作用。利用HBV特異蛋白在體外預先制備的DC而制成的自體疫苗可望成為未來的治療方法[30]。
4 其他藥物
抗肝炎病毒基因治療的藥物或策略包括反義技術、核酶、基因免疫、干擾肽或蛋白質、負性突變體、單鏈抗體、RNAi等目前正在研發之中。
5 結語與展望
抗病毒治療的成敗是慢性肝炎能否治愈的關鍵，由于乙肝病毒進入肝細胞后產生的cccDNA對各種藥物的耐藥性，細胞核內的cccDNA難以清除，造成停藥后，病毒復制的反彈以及長期藥物治療所導致的乙肝病毒突變株的產生，使得到目前為止，對HBV的治療尚沒有一種特效的藥物能夠達到滿意的治療效果。
隨著分子生物學和重組DNA技術的迅速發展，基因治療及基因疫苗的進一步研制，清除HBV，徹底治療慢性乙肝將成為一種可能，但總的說來，HBV基因治療的研究仍有相當長的路要走。盡管HBV基因治療困難重重，但基因技術仍為HBV治療帶來了新的希望，通過廣大學者不懈的努力，相信在不久的將來會取得一定的突破。
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